「患儿，女，因 1 岁多时走路不稳就诊。外婆和母亲都有矮小、O 型腿、易骨折等症状」

 

面对上述病例，相信很多医生心中都有了初步判断，那下一步该如何确诊呢？

 

近些年，随着高通量测序技术的发展，全外显子组测序（WES）在诊断遗传性罕见病中扮演着越来越重要的角色。事实上，上述病例就发生在上海儿童医学中心，经过 WES 后，发现一个基因突变，该突变可引起「低磷性佝偻病」，因为发现得早，患儿通过补充维生素 D 和磷酸盐合剂，将来完全可以避免发生骨软化症、O 型腿等骨骼畸形症状。

 

然而，面对这项新技术，摆在临床医生面前的问题是，怎样挑选 WES 产品呢？

 

为了回答这个问题，我们需要直击 WES 产品选择时的四大问题。

 

 

第 1 击：哪些性能是我们在 WES 选择时需要考量的？

 

全面覆盖数据库收录的基因区域（包含所有外显子）是 WES 产品最基本的性能。首先，WES 产品必须依托更新的数据库收录的基因信息进行设计，除了基因的覆盖也要确保外显子的覆盖。其次，对于较难捕获区域，如高 GC 区应当优化探针设计策略，提升捕获效率。比如，常染色体显性多囊肾病（ADPKD）基因外显子多达 46 个、无突变热点、基因内存在重复、部分区域 GC 含量高^[1]。对于该基因就既要求外显子覆盖全，又要求兼顾优化高 GC 区域。

 

第二个性能是特异性。特异性保障了探针所捕获下来的是我们的目标片段，业界常用中靶率（on-target rate）来评价这一指标。

 

第三个性能是均一性。由于不同区域的序列特点不一，探针捕获的表现不尽相同，如果探针均一性不好就会出现文库分子捕获不均匀，有些区域出现覆盖不足的情况，影响结果分析。一般我们用 20 × / 30 × 覆盖度或 fold-80 penalty 来评估这一指标。

 

最后一个性能是外显子组的设计大小。设计大小直接关系到所需的测序数据量大小，进而影响测序成本。

 

 

第 2 击：选择 WES 产品时的常见误区有哪些？

 

误区 1. 过分追求个别指标，而忽视了指标之间的关联性。WES 测序的目的就是全面检测致病基因和发现新的基因（突变），因而「全面覆盖」是前提。为了确保覆盖的全面性，在某些指标上是允许有所牺牲的。

 

误区 2. 误将部分指标性能与实际性能划等号。市面上有些 WES 产品在设计的时候，会放弃掉探针综合评分不高的区域（通常是高 GC 的较难捕获的区域），以保证产品的某些指标性能不被拉低，比如均一性。

 

误区 3. 片面的直接比较冠以相同名称的参数。各个指标的算法在行业内没有统一的标准，且这些指标受多个相关因素的影响。以中靶率为例，怎样的 reads 可被算为中靶的 reads、以哪个靶标区域来计算中靶率，均无统一标准。只要二者之一采用不同标准，同一份测序数据就会得到不同的中靶率。

 

 

第 3 击：WES 产品选择时应该关注哪些指标？

 

以数据库覆盖全为前提，综合考量中靶率、30 x 覆盖度等参数。常见性能包括均一性、特异性。均一性的指标包括 30 × 覆盖度、Fold-80 Penalty 等；特异性的指标通常用中靶率来衡量。

 

关于不同指标的意义、指标不好的影响，以及弥补方法可参见下表。

 

 

从这张表中我们可以看出，如果产品的数据库覆盖不全，是没有弥补方法的；而其它指标均是可以通过其它方法来弥补的。通常评估测序数据质量还会用到 Q30、比对率（mapping rate）、20 × 覆盖率，以及冗余率（duplication rate）。各项指标需要综合评估，但都应该以数据库完整覆盖为前提。

 

 

第 4 击：经常看到厂家宣传很高的中靶率和 30 × 覆盖度，靠谱吗？

 

指标的叫法虽然一样，但由于缺乏行业标准，有时这些指标所呈现的数据是建立在不同标准之下的。

 

注意点 1. 30 × 覆盖度与总的测序数据量有关，测序数据量越大，覆盖度越好。比如同一产品，测 10 G 的数据量与测 5 G 的数据量的情况下，10 G 数据量下被覆盖到 30 次的位点的比例肯定更多（图 1）。因此，如果要进行客观的比较，两款产品应该在相同的测序数据量下来比较 30 × 覆盖度。

图 1 覆盖度与总的测序数据量有关，测序数据量越大，覆盖度越好。如图，假定理想的覆盖度为 n×，在没有提高测序量的情况有，有一个外显子没有达到理想覆盖度（左，0.5n）；通过提高测序量后，所有外显子均达到或超过了 n×（右）。

 

注意点 2. 靶标区域的定义和中靶 reads 的计算阈值标准都会影响中靶率。

 

 

背景知识：

 

捕获探针在从片段化的基因组  DNA 上捕获外显子组序列时无法做到 100% 特异性捕获，既会捕获下目标区域，也会把一些非外显子的区域捕获下来（无效区域）（图 2）。数据分析时，软件会将 reads 进行拼接，去除无效区域，最终获得完整的全外显子组测序结果。以鱼网来形容用来捕获靶标的探针，鱼网覆盖的区域通常会比鱼大，这样才能捕到所有的靶标。鱼就是所谓的目标区域（target region）；网就是所谓 design region，也就是探针的设计区域，后者比前者更大。

 

图 2 为了完整捕获外显子，探针在设计时会有部分外延（延伸出外显子区域），因此探针所覆盖的设计区域要大于靶标区域。测序数据中外延区域的数据是无效数据。

 

中靶率是指比对到目标区域的 reads 的数量点总的 reads 数量的比例。用于比对 reads 的目标区域的选择，以及 reads 入组的阈值标准直接影响中靶率的计算。

靶标区域越大，能与它匹配上的 reads 数量越多

如果拿 design region 作为区域来计算中靶的 reads 数，中靶率就更高（图 3）。但这些为了捕获靶标区域而增加的其他区域对于我们是没有价值的；因此，我们更应该将 target region 作为目标区域来计算中靶率，以更好地反映捕获效率（特异性）。

 

图 3 以不同区域来比对 Reads，获得中靶 Reads 的数量就会不同。以 Target Region 来比对 Reads，中靶 Reads 数相对较少（绿色叠加到的峰面积）；以 Design Region 来比对 Reads，中靶 Reads 数相对较多（橙色叠加到的峰面积），但含有无效 Reads。

 

 

什么样的 reads 被算为中靶 reads 又可以有不同定义

 

通常用来定义 reads 是否中靶的标准是：测出的 reads 要有一半以上的碱基与外显子组的靶标区域匹配，我们将这些 reads 称为 centered reads，只有 centered reads 才会被计算在内；业内也把仅有几个碱基匹配上的 reads 算为中靶，也就是说，那些质量比较差的数据也被纳入进来，这样分子就变得更大，中靶率就显得更高（图 4）。

 

图 4 业界一般将有一半以上碱基与靶标区域匹配的 reads（centered reads）计算为中靶。

 

所以，虽然几个指标的名称、叫法都一样，但由于计算方式与标准的不同，这些参数的价值就大打折扣。

 

最后，回归到如何甄选 WES 全外产品？

总结为十二个字：「以设计为根本，参数指标为佐」，即：数据库全覆盖、参数综合考量、性能对称比较。

 

参考文献：

[1]. Rossetti S, Strmecki L, Gamble V, et al. Mutation analysis of the entire PKD1 gene: genetic and diagnostic implications. Am J Hum Genet. 2001 Jan;68(1):46-63.